5.1.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
样品：采购于恩施市菜市场。
试剂：三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸银、氢氧化钠、mrs合成培养基：国药集团化学试剂有限公司；d5625-01 dna提取试剂盒、dna marker、pcr清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；2xpcr mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rtaq、dntp mix、pmd18-t vector：大连宝生物技术有限公司；正向引物338f（加入7个核苷酸标签barcodes）和反向引物806r、pcr引物合成和测序：武汉天一辉远生物科技有限公司。
2.仪器与设备
verititm 96-well thermal cycler pcr仪、nanodrop 2000/2000c：美国thermo fisher公司；dcodetm system：美国bio red公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；miseq pe300高通量测序平台：美国illumina公司；r920机架式服务器：美国dell公司；ct15re冷冻离心机：日本hitachi公司；bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；whitley dg250厌氧工作站：英国dws公司。
3.方 法
（1）样品宏基因组提取与检测
采用试剂盒方法提取腐乳样品中的宏基因组，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，测定各样品宏基因组dna浓度。
（2）pcr-dgge
将宏基因组dna浓度调整为一致后作为模板细菌16s rrna v3区域基因片段pcr扩增。采用25 μl体系进行pcr扩增：10×pcr buffer（含mg2 ）2.5 μl，dntp 2 μl，上下游引物各0.5 μl，rtaq 0.5 μl，模板1 μl，灭菌超纯水补充至25 μl。其中上游引物为all-gc-v3f（5’-cgcccggggcgcgccccgggcggcccgggggcaccgggggcctacggg aggcagcag-3’），下游引物为all-v3r（5’-attaccgcggctgctgg-3’）。扩增程序：95 °c 4 min，95 °c 30 s，55 °c 30 s，72 °c 30 s，30个循环，72 °c10 min。扩增结束后，pcr扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。(https://www.daowen.com)
采用8%的聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝38.93∶1.07）、变性范围为35%-52%（100%变性剂：尿素42 g，去离子甲酰胺40 ml）的凝胶进行分析。将凝胶置于温度为60 °c的0.5 x tae电泳缓冲液中，于每个胶孔点样10 μl，先电压120 v，持续80 min，后电压80 v，持续13h。电泳结束后，采用硝酸银法染色，使用扫描仪对电泳图进行观察拍照，找出各泳道优势条带并切胶，将胶块捣碎于50 μl无菌超纯水中，4 °c静置过夜。用不含gc夹的引物（all-v3f和all-v3r）将回收胶块进行pcr扩增，扩增体系及条件同上。用清洁试剂盒纯化pcr产物，并与载体（pmd18-t）连接后转化到感受态细胞中进行克隆培养，筛选阳性克隆菌液送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。使用bioedit软件将去除载体序列后在ncbi中进行同源性比对。
（3）样品细菌16s rrna pcr扩增及miseq高通量测序
参考王玉荣[15]方法进行样品细菌16s rrna pcr扩增及miseq高通量测序。采用20 μl扩增体系：5×pcr缓冲液4 μl，dntp mix 2 μl，上游引物338f（5’-actcctacgggaggcagca-3’）和下游引物806r（5’-ggactachvgggtwtctaat-3’）各0.8 μl，rtaq酶0.4 μl，模板10 ng，灭菌超纯水补充至20 μl。扩增条件为：95 °c预变性3 min，95 °c变性30 s，55 °c退火30 s，72 °c延伸45 s，共运行30个循环，72 °c延伸10 min。扩增结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，合格后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。
（4）序列拼接及质量控制
参照于丹[16]和陈泽斌[17]的方法，在除去不合格序列、barcode序列和引物序列的基础上，将数据序列进行拼接。同时利用pynast软件将所有的序列对齐，采用uclust算法将相似度＞97%序列划分为一个操作单元（operational taxonomic units，otu），从而进行物种鉴定和相对含量分析，对腐乳中的微生物多样性进行解析。
（5）腐乳中乳酸菌的分离与鉴定
腐乳样品中乳酸菌的分离采用倍比稀释涂布法。将各样品稀释液涂布于改良mrs固体培养基（含1.5% caco3）上，置于37 °c厌氧培养48 h，挑选具有不同特征且透明圈现象明显的菌落划线纯化。纯化后的菌株进行革兰氏染色镜检、过氧化氢试验及冻存。使用参考文献[18]提取各菌株dna，并参照张晓辉[19]方法使用正向引物27f（5’-agagtttgatcctggctcag-3’）和反向引物1495r（5’-ctacggctaccttgttacga-3’）进行pcr扩增和测序。测序结果分析同（3）。
4.数据处理
通过origin 8.5软件对dgge图谱特征条带序列进行统计，同时对样品的稀释曲线（rarefaction curve）及香农指数曲线（shannon diversity index curve）的作图。系统发育树由bioedit软件和mega 5.0软件共同绘制。使用office 2016绘制平均相对含量＞5%的属水平饼图。venn图由在线绘图网页（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行绘制。相对含量＞1.5%的核心otu热图由matlab 2010b绘制。