2.5.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
泡萝卜：采集自恩施市菜市场；mrs培养基：青岛海博生物技术有限公司；饱和酚、氯仿、溴化十六烷基三甲基铵（hexadecyl trimethy lammonium bromide，ctab）、乙二胺四乙酸、异戊醇、乙醇、三羟甲基氨基甲烷、醋酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠和碳酸钙：国药集团化学试剂有限公司；axygen pcr 清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；引物27f/1495r：由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；dl15000 maker、dl2000 maker、10×pcr buffer、dntp mix、r taq酶、pmd18-t克隆载体：宝生物工程（大连）有限公司。
2.仪器与设备
hbm-400b拍击式无菌均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；dws dg250厌氧工作站：英国 don whitley 公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；r40-iib2生物安全柜：中国青岛海尔；5810r台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；ptc-100pcr仪：美国bio-rad公司；fluorchem fc3化学发光凝胶成像系统：美国 proteinsimple 公司；3-18k离心机：德国sigma实验室离心机股份有限公司；ultrascan pro色度仪：美国hunterlab公司；ta.xt plus质构仪：英国sms公司；pen3电子鼻：德国airsense公司。
3.方 法
（1）样品的采集
2017年11月于恩施土家族苗族自治州恩施市舞阳坝菜市场和六角菜市场（109.47°n，30.3°e）采集泡萝卜样品5份，样品在采集过程中应符合以下条件：① 样品未经过热处理；② 样品无异味、无霉变；③ 制作泡萝卜的品种为白萝卜且产地在恩施市；④ 泡萝卜的加工地亦在恩施市。从每个采样点采集泡萝卜样品约500 g装入采样袋中并置于含有冰袋的采样箱中迅速带回实验室。
（2）乳酸菌的分离
使用灭菌刀和砧板将样品切碎后，加入适量生理盐水后装入无菌厌氧袋中，并使用拍击器拍击3 min。采用倍比稀释法对拍击好的样品进行稀释，取－2、－3、－4和－5四个梯度稀释液涂布于含有1.0%碳酸钙的mrs固体培养基上，于dg250厌氧工作站中37 °c培养48 h，工作站中通入含有氮气、氢气和二氧化碳的混合气体，其体积比分别为85∶10∶5[8]。选择菌落数在30～300间的平皿，按照菌落大小、颜色和是否有透明圈等特点挑取单菌落，划线纯化3次后进行过氧化氢酶实验，同时进行革兰氏染色并对菌株形态进行观察，将过氧化氢酶实验为阴性而革兰氏染色为阳性的菌株定义为潜在乳酸菌菌株。
（3）乳酸菌的鉴定
使用ctab法进行潜在乳酸菌菌株基因组dna的提取[9]，并以它为模板进行pcr扩增，pcr扩增靶点为16s rrna，pcr扩增引物为27f/1495r，其中正向引物序列为5’-agagtttgatcctggctcag-3’，反向引物序列为5’-ctacggctaccttcttacga-3’。pcr扩增体系（25 μl）为：正反引物（10 μmol/μl）各0.5 μl，模板dna 0.5 μl，10×pcr buffer 2.5 μl，dntp mix 2 μl，r taq酶0.3 μl，加超纯水至25 μl。pcr扩增程序为：94 °c预变性4 min；94 °c变性45 s，55 °c退火45 s，72 °c延伸90 s，30次循环；72 °c延伸10 min，4 °c保温[10]。使用1.0%琼脂糖凝胶电泳对基因组dna和pcr扩增产物分别进行浓度和纯度的定性检测，检测合格后的pcr产物使用axygen pcr清洁试剂盒进行清洗，清洁产物进一步连接转化后挑取阳性克隆子送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。测序公司反馈回的序列在ncbi网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）采用blast方法与模式菌株进行比对进而明确其种属分类地位。(https://www.daowen.com)
（4）乳酸菌菌株纯种发酵泡萝卜的制备
乳酸菌分离株活化三代后，10 000 r/min离心5 min弃上清，加入10 ml生理盐水吹打均匀备用，白萝卜切成1 cm×1 cm×5 cm条状备用。取白萝卜350 g、食盐39.5 g和煮沸冷却的水600 ml装入1 l蓝盖瓶，按照1.5×107/g白萝卜的比例接入菌悬液，25 °c发酵7 d。设置不接乳酸菌自然发酵的泡萝卜为对照组。
（5）泡菜水色度的测定
将发酵结束后的泡菜水10 000 r/min 离心5 min取上清备用。使用光阱和白板对色度仪校正后，将泡菜水装入50 mm×10 mm的石英比色皿中，采用透射模式对样品的l*（亮度）、a*（红绿度）和b*（黄蓝度）进行测定，每个样品平行测定3次[11]。
（6）泡菜质构的测定
采用穿刺模式对泡萝卜的咀嚼性、脆性和硬度进行测定，其中测试模式为穿刺模式，探头为p/2柱形探头（直径为2 mm），测试前速率为1 mm/s，测试速率为5 mm/s，测试后速率为5 mm/s，压缩比为50%，最小感知力5 g[12]。每个样品取5个泡萝卜条，每个萝卜条取3个测试点。
（7）基于电子鼻技术泡菜风味品质的评价
取15 ml泡菜水于电子鼻样品瓶中，55 °c保温10 min且室温平衡10 min后使用电子鼻进行测定，传感器清洗时间为90 s，插入时间为5 s，测试时间为60 s，进样流量为120 ml/min，内部流量为120 ml/min[13]。每个样品平行测定3次，取49 s、50 s和51 s数据求平均值。
（8）统计分析
统计分析采用主成分分析法（principal component analysis，pca）对泡萝卜品质进行评价。使用mega7.0软件绘制系统发育树，使用sas9.0软件进行pca，使用origin2017软件绘图。