4.2.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
米酒：于2018年2月采集自恩施市10个农户家中。qiagen dneasy mericon food kit基因组dna提取试剂盒：德国qiagen公司；5×transstarttm、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dntp）mix、fastpfu buffer和fastpfu fly dna聚合酶（5 u/μl）：北京全式金生物技术有限公司；dna 1000试剂盒：美国agilent公司。正向引物ssu0817f（5’-ttagcatggaataatrraatagga-3’）和反向引物ssu1196r（5’-tctggacctggtgagtttcc-3’）：武汉天一辉远生物科技有限公司。
2.设备与仪器
5810r台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；2100芯片生物分析仪：美国agilent公司；nd-2000c微量紫外分光光度计：美国nanodrop公司；vetiri梯度基因扩增仪：美国ab公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；powerpactmbasic稳压仪和uvpcds8000凝胶成像分析系统：美国bio-rad公司；miseq高通量测序平台：美国illumina公司；r920机架式服务器：美国dell公司。
3.方 法
（1）宏基因组dna提取与检测
取50 g米酒样品置于无菌离心杯中400 g离心10 min以去除米粒等固体杂质然后取上清液，将上清液以4 000 r/min的离心力离心10 min收集菌体。参照dna提取试剂盒中的方法对收集的菌体进行宏基因组dna提取并用微量紫外分光光度计检测提取dna的od260 nm/280 nm是否在1.8～2.0之间，并记录各样品dna浓度，将符合要求的样品dna置于－20 °c备用。(https://www.daowen.com)
（2）pcr扩增及测序
参照王丹丹[15]的方法对样品真菌18s rrna的v4～v5区进行pcr扩增，体系为20 μl：5×pcr buffer 4 μl，2.5 mmol/l dntps mix 2 μl，5 μmol/l正反向引物（正向引物上加7个核苷酸标签）各0.8 μl，5 u/μl fastpfu fly dna聚合酶 0.4 μl，dna模板 10 ng，剩余体积用无菌超纯水补齐；扩增条件参照陈庆金的方法略作改动[16]：95 °c预变性3 min；95 °c变性30 s，55 °c退火30 s，72 °c延伸45 s，30个循环；72 °c完全延伸10 min。扩增结束后用无菌超纯水将1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格的扩增产物浓度稀释至100 nmol/l，并用干冰将其寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行miseq高通量测序。
（3）序列质量控制及分析
miseq测序完成后根据序列间的重叠关系将返回的正反向成对单链序列拼接成一条完整dna序列，要求拼接时满足以下任一条件的序列予以剔除：重叠区的碱基数小于10 bp、核苷酸标签碱基发生错配、引物碱基错配数大于2bp或最大错配比率大于0.2。剩下的序列再按核苷酸标签序列将其划分至对应的样品中并校正序列方向，最后切除正反引物及核苷酸标签，若切除的引物和核苷酸后序列长度小于50 bp，则该序列亦舍弃。
序列质控合格后采用qiime（v1.7.0）分析平台对序列进行分析[17]，用uclust软件[18]首先以100%的相似度得到单一序列，然后以97%的相似度建立操作分类单元（operational taxonomic units，otu），紧接着从每个otu中挑选一条代表性序列与silva[19-20]数据库进行比对，确定各序列和各otu的微生物学分类地位，进而对米酒真菌的α多样性指数和β多样性指数进行计算。
（4）多元统计学分析
使用发现物种数和香农指数对真菌丰度和多样性进行分析，采用基于分类操作单元加权unifrac距离的聚类分析和基于欧氏距离的差异分析对样品真菌群落结构差异进行研究，采用曼-惠特尼检验（mann-whitney test）对不同聚类间的组间差异显著性进行分析。采用软件originpro2017c绘图。