4.1.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
米酒：采集自湖北省恩施土家族苗族自治州的农户家中，所有样品均为传统自然发酵且处于发酵后期。
三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、乙醇、冰乙酸、甲醛、硝酸银、氢氧化钠、碳酸钙：国药集团化学试剂有限公司；mrs合成培养基：青岛海博生物技术有限公司；qiagen dneasy mericon food kit宏基因组提取试剂盒：德国qiagen公司；dna marker、pcr清洁试剂盒：京科博汇智生物科技发展有限公司；2pcr×mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rtaq、dntp mix、pmd18-t：大连宝生物技术有限公司；dgge扩增用引物all-gc-v3f/all-v3r、正向含有7个核苷酸标签（barcode）的miseq测序用引物338f/806r、乳酸菌鉴定用引物27f/1495r、鉴定阳性克隆用引物m13f（-47）/m13r（-48）：武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
2.仪器与设备
veriti pcr扩增仪：美国ab公司；nanodrop 2000微量紫外分光光度计：美国nanodrop公司；dcodetm system：美国bio-rad公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；miseq pe300高通量测序平台：美国illumina公司；r920机架式服务器：美国dell公司；ct15re冷冻离心机：日本hitachi公司；bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；dg250厌氧工作站：英国dws公司；eclipse ci生物显微镜：日本nikon公司。
3.方 法
（1）米酒中微生物宏基因组dna提取
参照qiagen dneasy mericon food kit试剂盒使用说明提取10个米酒样品中微生物的宏基因组dna，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，并使用nanodrop检测其浓度。
（2）pcr扩增米酒样品细菌16s rrna基因片段
将各样品宏基因组dna浓度做适当稀释并确定浓度一致，使用带有gc夹的正向引物all-gc-v3f（5’-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggc ccg ggg gca ccg ggg gcc tac ggg agg cag cag-3’）和反向引物all-v3r（5’-att acc gcg gct gct gg-3’）对样品dna的v3区域进行16s rrna pcr扩增。扩增体系为25 μl：10×pcr buffer 2.5 μl，dntp mix 2 μl，all-gc-v3f 0.5 μl，all-v3r 0.5 μl，dna模板量 2 μl，rtaq酶 0.5 μl，ddh2o 17 μl。反应条件为95 °c 预变性4 min，95 °c 变性30 s，55 °c 退火30 s，72 °c延伸30 s，30个循环，72 °c完全延伸 10 min。pcr扩增结束后，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
（3）dgge分析
将上述检测合格pcr扩增产物作为模板进行dgge凝胶电泳。使用8%聚丙烯胺胶，上层胶为0%变性剂，下层胶为35%～65%梯度变性剂。电泳条件：温度为60 °c，电泳缓冲液为0.5 tae，点样量为10 μl，先120 v，78 min，使pcr扩增产物快速通过上层胶，后80 v，13 h。
（4）dgge优势条带分析(https://www.daowen.com)
电泳结束后对凝胶进行硝酸银染色，找出特异性条带并进行回收、扩增、清洁、连接、转化和克隆鉴定，筛选出阳性克隆子送往武汉天一辉远生物有限公司进行测序。测序结果使用bio edit软件将序列进行拼接，并在ncbi blast中比对查询。
（5）米酒中细菌16s rrna pcr扩增和miseq高通量测序
参照沈馨[20]方法，将（1）中样品总dna作为模板进行16s rrna pcr扩增。扩增体系：5×pcr buffer 4 μl，dntp mix 2 μl，338f和806r各0.5 μl，rtaq酶0.4 μl，dna模板 10 ng，ddh2o 12.6 μl。其中引物序列为338f（5’-actcctacgggaggcagca-3’）/806r（5’-ggactachvgggt-3’）。扩增反应条件为：95 °c 预变性3 min；95 °c变性30 s，55 °c退火30 s，72 °c延伸45 s，循环30次，72 °c完全延伸10 min。其扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行miseq测序。
（6）序列拼接和质量控制
参照王玉荣[21]方法，对miseq高通量下机序列进行拼接和质量控制。首先去除不合格序列，包括碱基数＜50 bp、碱基错配比率＞0.2、barcode存在碱基错配和引物错配碱基数＞2 bp的序列，其次去除barcode和引物序列，将剩余序列合并为一个文件以完成后续分析。
（7）生物信息学分析
参照王玉荣方法[22]，使用qiime分析平台对序列进行生物信息学分析。在将各序列校准对齐后，使用uclust两步法归并建立操作分类单元（operation taxonomic unit，otu）。选出代表性序列在greengenes数据库中进行同源性比对，确定各otu的种属地位，同时利用chao 1指数和shannon 指数评价微生物菌群的丰度和多样性。
（8）米酒中乳酸菌的分离与纯化
使用倍比稀释涂布的方法，将各样品稀释液均匀地涂布于mrs（含1.2%～1.5�co3）固体培养基上，置于dg250厌氧工作站中（85%n2，5%co2及10%h2），37 °c培养48 h。挑选具有透明圈且形状大小不一的特征菌落进行划线纯化2～3次，将革兰氏染色为阳性且过氧化氢酶试验为阴性的菌落进行保存。
（9）米酒中乳酸菌的鉴定
提取各纯化菌株dna，参考张晓辉[23]中的方法使用引物27f（5’-agagtttgatcctggctcag-3’）和1495r（5’-ctacggctacc ttgttacga-3’）进行pcr扩增。将扩增产物进行检测、清洁、连接、转化和克隆鉴定，筛选出阳性克隆子送往武汉天一辉远生物有限公司进行测序。测序结果使用bio edit软件将序列进行拼接，并在ncbi blast中比对查询。
4.数据分析
使用bio edit软件和mega 5.0软件采用比邻法构建系统发育树，使用origin 8.5软件对miseq高通量测序结果中优势门相对含量、优势属相对含量和otu出现次数进行绘图。使用matlab 2010b软件绘制核心otu相对含量的热图。