3.2.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
梅干菜mgc01、mgc02和mgc03：主要原料为雪里蕻。于2017年12月采集自湖北省恩施地区土桥坝菜市场。
氢氧化钠、碳酸钙、过氧化氢、三氯甲烷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钙、十二烷基硫酸钠、酚、氯仿、异戊醇、溴化十六烷基三甲铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，ctab）和醋酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；mrs培养基：青岛海博生物技术有限公司；axygen清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；10×pcr buffer、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dntp）mix、dna聚合酶（5 u/μl）、溶菌酶（400 u/μg）、蛋白酶k（20 u/μg）、pmd18-t vector和solution i：宝生物工程（大连）有限公司；6×loading buffer、dl500和dl2000 dna marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；2×pcr mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；qiagen dneasy mericon food kit提取试剂盒：德国qiagen公司；引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，各引物信息如表3-3所示。
表3-3 实验所用各引物序列信息
注：“f”表示正向引物；“r”表示反向引物。
2.仪器与设备
hr40-iib2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；verititm 96孔梯度pcr扩增仪：美国ab公司；dyy-12水平电泳仪：北京市六一仪器厂；nd-2000c微量紫外分光光度计：美国nano drop公司；lrh-70生化培养箱：上海一恒科技有限公司；dg250厌氧工作站：英国dws公司；5810r台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；eclipse ci生物显微镜：日本nikon公司；uv pcds8000凝胶成像分析系统：美国bio-rad公司。
3.方 法
（1）宏基因组dna提取(https://www.daowen.com)
参照qiagen dneasy mericon food kit提取试剂盒中的方法提取梅干菜样品宏基因组dna，并用微量紫外分光光度计检测dna纯度及浓度。
（2）基于miseq高通量测序技术的梅干菜细菌多样性评价
细菌16s rrna扩增及测序：以微生物宏基因组dna为模板进行pcr扩增。扩增体系为5×fastpfu buffer 4 μl、2.5 mmol/l dntp mix 2 μl、5 μmol/l 的正/反引物（338f/806r）各0.8 μl、5 u/μl rtaq 0.4 μl、dna模板 10 ng，双蒸水（ddh2o）补充至20 μl[13]。pcr扩增条件为95 °c、3 min；95 °c、30 s，55 °c、30 s，72 °c、45 s，循环30次；72 °c再延伸10 min。pcr扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行miseq高通量测序。
质量控制：对测回的序列进行拼接，拼接时去除重叠区域碱基数＞10 bp、最大错配率＞0.2和样品特异性条形码（barcode）或引物碱基错配的序列，拼接后依据barcode信息将序列划分至各样品中以备后续分析[10]。
数据分析：使用qiime数据分析平台，参照caporaso j g等[14-15]的方法对质控后的序列进行分析。首先以97%相似度划分操作分类单元（operational taxonomic units，otu），然后利用greengenes和rdp数据库进行同源性比对，统计各分类水平上细菌多样性。
（3）梅干菜中乳酸菌菌株的分离鉴定
乳酸菌分离纯化：采用稀释涂布平板法将样品稀释液涂布于含1.0%～1.2%碳酸钙的mrs琼脂培养基上，37 °c厌氧培养48 h后挑选周围有透明圈的单菌落进行纯化，将革兰氏染色阳性和过氧化氢酶阴性的纯种菌株用30%的甘油进行菌种保藏。
乳酸菌dna提取与鉴定：采用ctab法[16]提取纯化菌株的dna，然后以提取的dna为模板进行pcr扩增（除pcr扩增所需引物为27f和1495r外，pcr扩增体系和条件均与（2）相同）、琼脂糖凝胶电泳检测、产物清洁、连接pmd18-t载体并转化至大肠杆菌（escherichia coli）top10，挑取阳性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。将测序公司返回的序列进行拼接并去除正反引物后置于美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，ncbi）上进行同源性比对，使用mega 7.0中的邻近法（neighbor-joining，nj）法构建系统发育树。
（4）数据处理
使用折线图评判本研究测序深度是否合适，使用维恩（venn）图显示不同样品中共有或特有的otu及序列数，使用柱状图展示不同样品中各门和属水平细菌种类和含量，使用系统发育树展现不同菌株间进化关系。折线图和柱状图使用origin2017软件绘制。venn图由venny2.1.0在线绘制，系统发育树由mega 7.0绘制。