1.1.2 结果与讨论-凯发娱乐
1.基于dgge技术的腊肠细菌多样性分析
本研究首先使用pcr-dgge技术对腊肠样品中细菌的多样性进行了分析，其指纹图谱如图1-1所示。
图1-1 腊肠中细菌的dgge图谱
注：编号1～7为优势条带编号，分别对应lc01～lc07。
由图1-1可知，条带6和条带7亮度远高于其他5个条带且在每个样品中均存在，这说明条带6和条带7所代表的细菌可能为腊肠样品中的优势菌属。值得一提的是，条带1～5亮度偏暗，且其仅在某几个腊肠样品中存在，这说明这些条带代表的菌属在腊肠中的含量偏低，且可能仅存在于部分样品中。由图1-1亦可知，lc1样品的条带数最多而lc5样品最少，这说明lc1样品的细菌多样性最高而lc5最低。各条带比对分析结果如表1-1所示。
表1-1 细菌dgge条带测序结果
由表1-1可知，经比对发现腊肠样品中细菌由anaerostipes hadrus（毛螺旋菌属）、acinetobacter johnsonii（不动细菌属）、vibrio litoralis（弧菌属）、staphylococcus equorum（葡萄球菌属）、brochothrix thermosphacta（环丝菌属）和未知分类地位的不可培养细菌构成，且brochothrix（环丝菌属）为其优势细菌属。
2.基于miseq高通量测序技术的腊肠细菌多样性评价
较之pcr-dgge技术，以miseq为代表的第二代高通量测序技术具有通量高的优点，且实现了菌群的相对定量分析，因而本研究进一步采用miseq高通量测序技术对5个腊肠样品的细菌多样性进行了解析，同时对pcr-dgge的结果进行了验证。通过miseq高通量测序，本研究5个腊肠样品共产生193 486条高质量的16s rdna序列，平均每个腊肠样品产生38 697条，切除引物和barcode后序列长度的分布情况如图1-2所示。
图1-2 序列长度分布图
由图1-2可知，193 486条高质量的16s rdna序列中有175 308条集中在440～459 bp，占到序列总数的90.61%，18 069条集中在420～439bp，占到序列总数的9.34%。使用qiime平台，对高质量序列进行生物信息学分析，共有193 356条序列通过align（对齐），按照100%相似性进行uclust后共得到84 979条代表性序列，按照97%相似性进行uclust后共得到8 057个otu且没有发现嵌合体。本研究进一步对otu在5个样品中出现的频率和包含序列数进行了统计，结果如图1-3所示。
图1-3 otu出现频率和包含序列数统计
由图1-3可知，在5个样品中出现1次、2次、3次和4次的otu分别有6 742个、771个、289个和142个，分别占otu总数的83.68%、9.57%、3.59%和1.76%，其包含的序列数分别为18 341条、11 093条、7 039条和19 140条，分别占所有质控后合格序列数的10.21%、5.76%、3.88%和10.13%。虽然核心otu仅有113个，仅占otu总数的1.40%，但其包含的序列数为137 743条，占所有质控后合格序列数的70.02%。由此可见，5个腊肠样品共有大量的细菌类群。(https://www.daowen.com)
使用rdp和greengenes数据库比对后，所有序列鉴定到14个门、58个纲、90个目、110个科和261个属。各样品测序情况及各分类地位数量如表1-2所示。
表1-2 样品测序情况及各分类地位数量
注：超1指数和香农指数均在测序量为28 410条序列时计算所得。
由表1-2可知，lc1样品的超1指数和香农指数值均最大，而lc5样品的两个值均最小，这说明lc1样品的细菌多样性最高而lc5最低，与pcr-dgge结果一致。本研究进一步在门水平上对腊肠样品中细菌多样性进行了解析，结果如图1-4所示。
图1-4 腊肠中优势细菌门相对含量的比较分析
由图1-4可知，腊肠样品中平均相对含量大于1.0%的细菌门分别为firmicutes（硬壁菌门）、proteobacteria（变形菌门）、cyanobacteria（蓝细菌）、bacteroidetes（拟杆菌门）和actinobacteria（放线菌门），其平均相对含量分别为57.01%、30.43%、7.67%、2.63%和2.01%。此外，另有序列被鉴定为tm7、acidobacteria（酸杆菌门）、fusobacteria（梭杆菌门）、deinococcus-thermus（异常球菌-栖热菌门）、chloroflexi（绿弯菌门）、deferribacteres（脱铁杆菌门）、spirochaetes（螺旋原虫）和tenericutes（柔膜菌门），但其累计平均含量仅为0.13%。由此可见，腊肠样品中的细菌主要隶属于firmicutes（硬壁菌门）和proteobacteria（变形菌门），其比例占到细菌总数的87.44%。
经rdp和greengenes数据库比对发现有13.72%的序列无法鉴定到属水平，相对含量大于1.0%的细菌属如图1-5所示。
图1-5 腊肠中优势细菌属相对含量的比较分析
由图1-5可知，腊肠样品中共有11个细菌属的平均相对含量大于1.0%，其中brochothrix（环丝菌属）、staphylococcus（葡萄球菌）、lactobacillus（乳酸杆菌）和leuconostoc（明串珠菌属）4个属隶属于firmicutes（硬壁菌门），平均相对含量分别为38.34%、9.79%、2.80%和2.29%，psychrobacter（嗜冷杆菌）、photobacterium（发光杆菌）、pseudomonas（绿脓杆菌）、acinetobacter（不动细菌属）、vibrio（弧菌）、pantoea（泛菌属）和klebsiella（克雷伯氏菌）7个属隶属于proteobacteria（变形菌门），平均相对含量分别为7.55%、5.90%、4.82%、2.19%、1.69%、1.48%和1.33%。由此可见，腊肠样品中含量最多的细菌为brochothrix（环丝菌属），这与dgge结果一致。
本研究对142个相对含量大于1.0%的核心otu进行了统计，其结果如图1-6所示。
图1-6 腊肠中优势核心otu相对含量的比较分析
由图1-6可知，腊肠样品中otu6108（隶属于brochothrix）、otu4346（隶属于psychrobacter）、otu4525（隶属于staphylococcus）、otu1679（隶属于lactobacillus）、otu1064（隶属于vibrio）和otu7759（隶属于staphylococcus）的平均含量大于1.0%，其平均相对含量分别为36.19%、4.28%、3.35%、2.42%、1.50%、1.49%。由此可见，5个腊肠样品共有大量的细菌类群，6个核心otu的含量就占到了序列总数的49.23%。