1.2.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
腊肉：恩施土家族苗族自治州农家自制。聚丙烯酰胺、尿素、n,n-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、冰醋酸、甲醛和硝酸银等化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；qiagen dneasy mericon food kit提取试剂盒，购于德国qiagen公司；5×fastpfu buffer、10×pcr buffer、dntps mix、dna聚合酶（5 u/μl）、pmd18-t载体，购自宝生物工程（大连）有限公司；6×loading buffer、dl2000和dl15000 dna marker，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；2×pcr mix，购于南京诺唯赞生物科技有限公司；dgge扩增引物all-gc-v3f（5’-cgcccggggcgcgccccgggcggcccgggggcaccgggggcct acgggaggcagcag-3’）/all-v3r（5’-attaccgcggctgctgg-3’）和高通量测序引物338f（5’-actcctacgggaggcagca-3’）/806r（5’-ggactachvgggt-3’）等均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。axygen清洁试剂盒，购于北京科博汇智生物科技发展有限公司；e.coli（大肠杆菌）top10，由本实验室保藏。
2.仪器与设备
hbm-400b拍击式无菌均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；5810r台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；nd-2000c微量紫外分光光度计：美国nano drop公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；verititm96孔梯度pcr扩增仪：美国ab公司；powerpactmbasic稳压仪和dcodetm system：美国bio-rad公司；uvpcds8000凝胶成像分析系统：美国bio-rad公司；miseq pe300高通量测序平台：美国illumina公司。
3.方 法
（1）样品前处理及宏基因组dna提取
参照gb/t 4789.17—2003《食品卫生微生物检验肉与肉制品检验》进行取样，加入灭菌水225 ml混匀后300 r/min离心10 min取上清液，然后以10 000 r/min的速度将上清液离心10 min，保留沉淀。按照qiagen dneasy mericon food kit试剂盒使用说明中的方法提取样品总dna并用微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度。(https://www.daowen.com)
（2）细菌pcr-dgge指纹图谱分析
以提取的dna为模板进行pcr扩增，扩增体系及反应参数参照文献26中的方法略做改动：10×pcr buffer 5 μl，dntp mix（2.5 mmol/l）4 μl，all-gc-v3f（10 μmol/l）和all-v3r（10 μmol/l）各1 μl，rtaq酶（5 u/μl）0.4 μl，dna模板1 μl，用无菌水将体系补齐至50 μl，混合均匀后置于pcr仪中94 °c预变性5 min；94 °c变性30 s，55 °c退火1 min，72 °c延伸90 s循环30次；然后72 °c完全延伸10 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。取10 μl扩增产物置于质量分数为8%、变性剂范围为35%～52%的聚丙烯酰胺凝胶中进行检测，电泳条件为：0.5×tae缓冲溶液恒温60 °c，120 v运行78 min后80 v维持13 h。电泳结束后将银染法染色的凝胶扫描成像，挑选优势条带切胶回收，然后使用不带gc夹子的引物进行扩增，清洁，连接pmd18-t载体并转化大肠杆菌top10，挑选两株单菌落进行阳性克隆鉴定，并将菌液送至测序公司测
（3）细菌miseq高通量测序分析
参照沈馨[27]的方法进行pcr扩增：20 μl体系中5×fastpfu buffer 4 μl，dntp mix（2.5mmol/l）2 μl，引物338f（5 μmol/l）和806r（5 μmol/l）各0.8 μl，rtaq（5 u/μl）0.4 μl，dna模板10 ng，剩余体积用无菌水补齐；反应参数为：95 °c，3 min；（95 °c 30 s，55 °c 30 s，72 °c 45 s，）30次循环；72 °c，10 min。扩增合格的产物寄出测序。序列下机后需进行拼接和质量控制，参照郭壮[28]的方法删除不合格序列后再根据各序列标签将序列划分至各样本中。利用qiime数据分析平台[29]划分操作分类单元（operational taxonomic units，otu），再从每个otu中挑选代表序列于greengenes[30]和rdp（ribosomal database project）[31]数据库中进行比对，确定其微生物分类水平，并计算各样品α多样性。
（4）统计学分析
dgge条带序列使用bioedit 7.0.9进行拼接和引物切除，然后将处理好的序列置于ncbi（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）上进行比对。根据各样品中发现序列数及otu数，计算各样品的超1指数和香农指数，并使用originpro 2017绘图。