1.3.2 结果与讨论-凯发娱乐
1.细菌dgge指纹图谱分析
pcr-dgge技术可有效区分长度相同但碱基存在差异的序列从而直观反映样品中微生物多样性及各样品中微生物差异[24]。本研究首先采用pcr-dgge技术对恩施腊鱼样品中细菌多样性进行研究，分析结果如图1-12所示。
图1-12 细菌dgge指纹图谱
注：条带1～条带6分别对应aly1～aly6。
由图1-12可知，在dgge指纹图谱中5个样品呈现出明亮不一的条带，其中条带aly2和条带aly6为所有样品中共有条带且条带较明亮，说明aly2和aly6为样品中共有细菌且含量较高；条带aly1、aly3、aly4和aly5为某些样品中特有条带，且在不同样品中条带亮度不同，说明各样品中都含独特细菌且同种细菌在不同样品间含量存在差异。值得一提的是，样品ly1中条带数量和亮度明显低于其他样品，说明该样品中细菌丰度和多样性均不及其他样品。本研究进一步将6条轮廓清晰的优势条带回收后扩增的序列与数据库进行比对，结果如图1-13所示。
图1-13 优势条带序列系统发育树
由图1-13可知，条带aly1、aly2和aly3与psychrobacter arcticus（北极冷杆菌）和psychrobacter glacincola（水栖冷杆菌）形成一个聚类，而aly4、aly5和aly6与lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）和lactobacillus pentosus（戊糖乳杆菌）形成一个聚类。由此可见，虽然利用pcr-dgge技术无法将各条带鉴定到种水平，究其原因可能与引物扩增区域较短有关，但不难发现腊鱼样品中的微生物以psychrobacter（嗜冷杆菌属）和lactobacillus（乳酸杆菌属）为主。曾令彬采用传统微生物学手段对腊鱼加工中微生物进行分离鉴定，发现其优势微生物菌群为乳酸菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌[9]，其研究结论与本研究存在一定的差异性，这可能是由于原料种类、地域以及传统微生物学手段的限制等因素造成的。值得一提的是，王建建研究发现野生银鲳消化道内主要菌群为psychrobacter（嗜冷菌属），而养殖银鲳消化道主要菌群为acinetobacter（不动杆菌属）和pseudomonas（假单孢菌属）[25]。此外，杨红玲研究发现石斑鱼肠道原籍psychrobacter sp.se6能抑制多种常见病原菌的生长，且能显著提高石斑鱼饵料利用率并增加其免疫力[26]。由此可见，恩施地区腊鱼样品中的嗜冷杆菌属可能主要来源于原料本身。
2.细菌miseq高通量测序分析
相对于基于纯培养的传统微生物手段以及dgge指纹图谱技术，以illumina miseq 为代表的第二代高通量测序技术可检测到样品中低丰度的菌群，从而能够更加真实准确地反映样本微生物多样性[27]。本研究采用miseq高通量测序技术从5个样品中共检测出84 721条合格序列，采用α多样性对序列进行分析时发现在测序深度为29 910条序列时ly1、ly2、ly3、ly4和ly5的chao1指数分别为574、1 085、1 149、843和1096，shannon指数分别为2.65、4.35、6.62、5.76和4.86，说明ly1中的细菌总数和丰富度最低而ly3中的最高，这与dgge分析结果相同。在97%的相似度下可将质检合格的序列划分至6 733个otu中，从每个otu中挑选代表性序列与数据库比对后发现，所有样品共检测出18个细菌门，将相对含量大于1.0%的定义为优势菌门，各优势菌门分析结果如图1-14所示。
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图1-14 细菌门水平平均相对含量饼图
由图1-14可知，腊鱼样品中优势细菌门主要为proteobacteria（变形菌门）、firmicutes（硬壁菌门）、bacteroidetes（拟杆菌门）和actinobacteria（放线菌门），其平均相对含量分别为61.29%、30.21%、5.34%和1.74%。值得一提的是，ly4中firmicutes的相对含量高达80.20%，ly2中firmicutes的相对含量仅为6.14%，ly1和ly3中proteobacteria和firmicutes的相对含量较为相近。吴燕燕[10]和钱茜茜[11]的研究均表明腌干鱼加工过程中主要微生物为bacteroidetes、firmicute和proteobacteria，其研究结果与本研究相同。
本研究进一步从属水平上分析细菌多样性，发现从ly1、ly2、ly3、ly4和ly5中检测到的细菌属数量分别为27个、227个、133个、136个和53个，仅有3.93%的序列不能鉴定到属水平。所有细菌属中平均相对含量大于0.1%的有32个，大于1.0%的有8个，现将平均相对含量大于1.0%的细菌属定义为优势菌属，则各优势菌属分析结果如图1-15所示。
图1-15 优势细菌属平均相对含量饼图
由图1-15可知，恩施腊鱼中的优势细菌属及其平均相对含量分别为psychrobacter（嗜冷杆菌属，35.70%）、brochothrix（环丝菌属，19.74%）、pseudomonas（假单胞菌属，7.13%）、staphylococcus（葡萄球菌属，7.12%）、acinetobacter（不动细菌属，4.19%）、vibrio（弧菌属，3.90%）、pseudoalteromonas（假交替单胞菌属，3.09%）和chryseobacterium（金黄杆菌属，1.98%），这些优势细菌属的累积平均相对含量高达82.84%，但pseudomonas、acinetobacter、vibrio和chryseobacterium在ly1中没有检出，chryseobacterium在ly5中亦没有检出。作为兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，brochothrix（环丝菌属）细菌可以在低氧和4 °c生长繁殖，是冷却猪肉中主要的一种污染菌[28]。本研究采集腊鱼样品中亦含有7.12%的staphylococcus（葡萄球菌），该菌广泛的分布于自然环境且多数为非致病菌，但作为人类化脓感染中最常见的病原菌，隶属于该属的s.aureus（金黄色葡萄球菌）可在加工、贮藏和运输过程中对食品造成污染[29]。值得一提的是，高通量测序技术亦检测出样品中含有lactobacillus（平均相对含量为0.83%）而dgge技术未检测出brochothrix、pseudomonas和staphylococcus等优势菌属以及其他相对含量更低的细菌属，这可能是由于dgge扩增引物、变性剂范围以及该技术的检测限较低等因素引起的。本研究进一步对otu在各样品中出现次数进行了统计，结果如图1-16所示。
由图1-16可知，只出现1次的otu有5 622个，占otu总数的83.50%，其所包含的序列有19 170条，占总序列数的9.43%；在5个样品中均存在的otu有64个，仅占otu总数的0.90%，但其所包含的序列有127 335条，占总序列数的62.67%，这说明5个腊鱼样本中含有大量共有细菌菌群。本研究将出现次数为5次且平均相对含量大于1.0%的otu定义为核心优势otu，其分析结果如图1-17所示。
图1-16 otu出现次数统计
图1-17 核心优势菌otu含量分布
由图1-17可知，样品中核心优势otu及其平均相对含量分别为otu230（19.65%）、otu6669（18.27%）、otu3491（5.84%）、otu3919（3.06%）、otu2016（1.71%）和otu285（1.59%），其中otu230、otu3919、otu2016和otu285隶属于psychrobacter，otu6669隶属于brochothrix，otu3491隶属于staphylococcus，说明psychrobacter、brochothrix和staphylococcus为恩施腊鱼样品中核心优势细菌属。由图1-17亦可知，ly1中otu6669（brochothrix）和ly3中otu3491（staphylococcus）的相对含量明显高于其他样品，而ly2和ly4中核心优势otu的累积平均相对含量要低于ly1、ly3和ly5，说明核心优势otu在各样品中的相对含量存在差异。