2.1.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
样品：3个泡辣椒样品均采购于恩施市土桥坝菜市场。
三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、n，n-亚甲基二丙烯酰胺均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；mrs培养基：青岛海博生物技术有限公司；d5625-01 dna提取试剂盒、dna marker、pcr清洁试剂盒：京科博汇智生物科技发展有限公司；2pcr×mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rtaq酶、dntp mix、pmd18-t vector：大连宝生物技术有限公司（takara）；正向引物338f（加入7个核苷酸标签barcodes）和反向引物806r：由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；pcr引物合成和测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成，引物信息表如表2-1所示。
表2-1 引物信息
2.仪器与设备
miseq pe300高通量测序平台：美国illumina公司；r920机架式服务器：美国dell公司；ct15re冷冻离心机：日本hitachi公司；verititm 96-well thermal cycler pcr仪、nanodrop 2000/2000c：美国thermo fisher公司；dcodetm system：美国bio red公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；dg250厌氧工作站：英国dws公司。
3.方 法
（1）泡辣椒样品宏基因组提取与检测
采用omega d5625-01试剂盒提取3个泡辣椒样品宏基因组，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测并用nanodrop测定其dna的浓度。
（2）泡辣椒样品细菌16s rrna pcr扩增及miseq高通量测序(https://www.daowen.com)
参照沈馨[17]的方法进行样品细菌16s rrna pcr扩增及miseq高通量测序，扩增体系为：4 μl 5×pcr缓冲液，2 μl dntp mix，正反向引物各0.8 μl，taq酶0.4 μl，dna模板10 ng，无菌超纯水补充至20 μl。扩增条件为：95 °c预变性3 min；95 °c变性30 s，55 °c退火30 s，72 °c延伸45 s，30次循环；72 °c延伸10 min。其扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后将浓度稀释至100 nmol/l，寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行miseq高通量测序。
（3）序列拼接及质量控制
参照周书楠[18]和吴燕燕[19]等人的方法，根据成对序列之间的重叠关系，将双端序列数据拼接成一条序列；其次根据barcode将所有序列划分到各个样品并对序列方向进行校正，最后切掉序列barcode和引物。使用qiime（v1.7.0）分析平台对拼接及质控成功的序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，otu）划分和物种鉴定（包括界、门、纲、目、科和属水平），并计算各分类单元的相对含量。
（4）泡辣椒中乳酸杆菌多样性解析
乳杆菌16s rrna基因片段pcr扩增所用正向引物为lacf-gc，反向引物为lacr。pcr扩增体系：2.5 μl 10×pcr buffer（含mg2 ），2 μl dntp，正向引物、反向引物和rtaq各0.5 μl，1 μl dna模板，无菌超纯水补充至25 μl。pcr扩增条件：95 °c预变性4 min，95 °c变性 30 s，55 °c退火 30 s，72 °c延伸30 s，循环30次，72 °c延伸10 min。扩增结束后，pcr扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
采用变性剂梯度为35%～52%（8%的聚丙烯酰胺）的凝胶进行dgge检测。在温度为60 °c的0.5 tae缓冲液中进行电泳，上样量为10 μl，先120 v，80 min，后80 v，13 h。电泳结束后，对dgge胶进行硝酸银染色，对凝胶电泳图进行观察扫描拍照并找出优势条带切胶回收。回收的条带用不含gc夹子的lacf和lacr进行扩增，扩增体系及条件与上述方法相同。将pcr清洁产物与pmd18-t载体连接后转化到感受态细胞中，经单克隆鉴定合格后送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。将测序结果除去两端载体的序列，然后使用bioedit软件进行拼接，拼接后在ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站中进行同源性比对。
（5）恩施泡辣椒中乳酸菌的分离与鉴定
将泡辣椒样品进行倍比稀释并涂布于含有碳酸钙的mrs固体培养基上，置于厌氧工作站恒温37 °c培养48 h。挑取有透明圈的菌落进行纯化、革兰氏染色和保藏。提取各菌株的dna（ctab法[22]），使用正向引物27f和反向引物1495r进行16s rrna扩增。在张鲁冀方法上稍作修改[23]，pcr扩增体系为：2.5 μl 10×pcr buffer（含mg2 ），2 μl dntp，正向引物、反向引物、rtaq和dna模板各0.5 μl，无菌超纯水补充至25 μl。pcr扩增条件：95 °c预变性 4 min，95 °c变性1 min，55 °c退火1 min，72 °c延伸90 s，30个循环，72 °c延伸10 min。pcr扩增结束后，取扩增产物2.5 µl用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。将pcr清洁产物按照（4）中的方法处理并对测定结果进行拼接和比对。
（6）数据处理
通过origin 8.5软件对平均相对含量＞1%的细菌属进行柱状图的绘制，venn图由在线网站（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行绘制。选取各菌株同源性相似度较高的序列与菌株原序列利用bioedit软件和mega 5.0软件绘制系统发育树。