1.3.1 材料与方法-凯发娱乐
1.主要材料与设备
主要试剂：尿素、聚丙烯酰胺、n,n-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、冰醋酸、甲醛、硝酸银、乙醇和十六烷基三甲基溴化铵购于国药集团化学试剂有限公司；qiagen dneasy mericon food kit提取试剂盒，购于德国qiagen公司；10×pcr buffer、dntps mix、dna聚合酶、pmd18-t vector和solutioni，购于宝生物工程（大连）有限公司；loading buffer、dl2000和dl15000 dna marker，购于宝日医生物技术（北京）有限公司；2×pcr mix，购于南京诺唯赞生物科技有限公司；axygen清洁试剂盒，购于北京科博汇智生物科技发展有限公司；大肠杆菌top10感受态细胞，本实验室制备。引物338f/806r（正向引物中加入7个核苷酸标签）、all-gc-v3f/all-v3r、all-v3f/all-v3r和m13f（-47）/m13r（-48）由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。各引物序列如表1-5所示。
表1-5 引物名称和序列信息
hbm-400b拍击式无菌均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；5810r台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；nd-2000c微量紫外分光光度计：美国nano drop公司；dyy-12电泳仪：北京六一仪器厂；verititm96孔梯度pcr扩增仪：美国ab公司；dcodetm system：美国bio-rad公司；uvpcds8000凝胶成像分析系统：美国bio-rad公司；miseq pe300高通量测序平台，美国illumina公司；r920机架式服务器：美国dell公司。
2.实验方法
（1）样品采集
从湖北省恩施市舞阳坝菜市场（109.47°n，30.3°e）采集5个腊鱼样品分别置于无菌采样袋中低温运回实验室。只有符合下列条件的样品才可纳入采集的范围：① 腊鱼由草鱼制作；② 腊鱼无肉眼可见杂质、寄生虫和虫卵；③ 腊鱼无病变、霉变和酸败等腐败变质现象；④ 腊鱼的制作地点需在恩施市范围内。
（2）样品前处理及宏基因组dna提取(https://www.daowen.com)
取25 g切碎的腊鱼加入225 ml无菌生理盐水后置于拍击器中拍击3 min，取出置于冷冻离心机中300 r/min离心10 min保留上清液，上清液以10 000 r/min离心10 min以便收集菌体，然后使用商业试剂盒提取腊鱼样品微生物宏基因组dna。
（3）基因组dna检测
使用1%的琼脂糖凝胶电泳以dl15000maker为参照查看是否扩增出清晰明亮大小合适的目的条带。然后以无菌超纯水为参照，取1 μl提取dna置于微量紫外分光光度计检测口检测其od260/280是否在1.8～2.0之间并确定各样品dna浓度。用无菌超纯水将检测合格的样品宏基因组dna浓度统一稀释至30 ng/μl备用。
（4）细菌dgge指纹图谱分析
细菌pcr扩增时使用引物对为all-gc-v3f/all-v3r，扩增体系中各试剂添加量及循环条件参照文献15中的方法略做改动：细菌pcr扩增体系为50 μl，模板量为1 μl，退火温度（tm）为55 °c。扩增结束后使用（2）中的方法检测扩增效果。在检测合格的体系中加入6 μl loading buffer混匀置于－20 °c备用。dgge凝胶中变性剂范围为35%～52%，待电泳槽中缓冲溶液的温度升至60 °c时在每个胶孔中加入10 μl混有loading buffer的pcr产物，先120 v电泳76 min使样品穿过上层胶后80 v维持13 h然后采用银染法染色。取优势条带回溶溶液2 μl为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系为25 μl：正反向引物all-v3f/all-v3r各0.5 μl，2×pcr mix 12.5 μl，剩余体积用无菌超纯水补齐。扩增循环条件及检测方法同上。参照杨春丽的方法将清洁后的扩增产物连接pmd18-t载体[16]，并采用热激法[17]将连接产物导入大肠杆菌top10中，挑选阳性克隆送去测序。
（5）细菌miseq高通量测序分析
首先对细菌16s rdna进行pcr扩增，扩增方法参照文献18中所描述的方法进行操作。扩增合格的dna使用干冰寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行miseq高通量测序。参照蔡宏宇[19]的方法对返回的序列进行质量控制并根据核苷酸标签（barcode）区分序列来源。然后利用qiime（v1.7.0）分析平台[20]对序列进行生物信息学分析：采用uclust法[21]划分分类操作单元（operational taxonomic units，otu），使用rdp（ribosomal database project）[22]和greengenes[23]数据库对otu中各代表性序列进行同源性比对确定其微生物分类地位，使用超1（chao1）指数和香浓（shannon）指数分析腊鱼样品中细菌多样性。
（6）多元统计学分析
使用bioedit 7.0.9和mega7.0处理dgge序列并绘制系统发育树，使用originpro 2017软件绘制其他图形。