2.4.1 材料与方法-凯发娱乐
1.材料与试剂
玉米粉、红辣椒、盐、花椒、白胡椒和白酒市售。
mrs培养基：蛋白酶、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二胺、磷酸氢二钾、mgso4 7h2o、mnso4 h2o、吐温-80和琼脂粉：青岛海博生物技术有限公司。
axygen pcr清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；dl15000 marker、dl2000 marker、pcr buffer、rtaq dna聚合酶、pmd18-t克隆载体：宝生物工程（大连）有限公司；引物m13f（-47）、m13r（-48）、27f和1492r武汉天一辉远生物科技有限公司。
2.仪器与设备
pgj-10-as型纯水机：武汉品冠仪器设备有限公司；hr40-ⅱb2型生物安全柜：中国青岛海尔；lhr-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；qyc-2102c全温培养摇床：上海新苗中国；ptc-100pcr仪：美国abi公司；fluorchemfc3化学发光凝胶成像系统：美国proteinsimple公司；sw-cj-2d双人单面净化工作台：苏州安泰；xfs-280手提式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰；dg250厌氧工作站：英国donwhitley公司；bg/bd-202ht卧式冷藏冷冻转换柜：中国青岛海尔；日立高速离心机：日本日立公司；haier医用低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；pen3电子鼻（配备w1c、w5s、w3c、w6s、w5c、w1s、w1w、w2s、w2w和w3s等10个金属氧化传感器）：德国airsense公司。
3.方 法
（1）鲊广椒样品的采集与处理
本实验的鲊广椒样品采集自湖北恩施的农户家中，采集后的样品放入采样箱中低温保存，立即送回实验室进行后续操作。
（2）乳酸菌的分离与鉴定
① 乳酸菌的分离。
采用倍比稀释法[7]对乳酸菌进行分离，取10－4、10－5、10－6三个梯度的稀释液涂布于mrs固体培养基（含1.5%的caco3），厌氧工作站30 °c培养48 h，培养结束后挑取菌落形态不同和透明圈明显的单菌落纯化3次，纯化后的菌株进行革兰氏染色[8]与过氧化氢酶实验，初步确认其为乳酸菌后保存于－80 °c冰箱中。
② 乳酸菌的鉴定。
将初步认为乳酸菌的菌株从－80 °c冰箱中取出活化，收集菌体采用ctab法[9]提取dna，以此为模板进行细菌16s rdna扩增。pcr扩增反应体系[10]（25 μl）：dna模板1 μl，rtaq酶0.5 μl，2.5 mmol/l dntp 2 μl，5 μmol/l 27f 0.5 μl，5 μmol/l 1495r 0.5 μl，10×pcr buffer2.5 μl，用ddh2o将体系补充到25 μl。扩增条件：94 °c预变性4 min，94 °c变性1 min，55 °c退火45 s，72 °c延伸1 min，30个循环，72 °c延伸10 min，4 °c结束。琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对符合目的片段大小的pcr产物进行清洁并与pmd18-t载体进行连接，转化到大肠杆菌top10中利用引物m13f（-47）和m13r（-48）鉴定阳性克隆子，阳性克隆子送往武汉天一辉远生物科技有限公司测序。测序结果去除引物序列后在ncbi上进行同源比对（见表2-10）。(https://www.daowen.com)
表2-10 引物名称与引物序列对应表
（3）鲊广椒的制作
选取鲊广椒中的优势菌株hbuas51131、hbuas51132、hbuas51133、hbuas51134、hbuas51135、hbuas51136、hbuas51141、hbuas51145、hbuas51146和hbuas51147等10株植物乳杆菌进行鲊广椒的制作。菌株在mrs液体培养基中分别活化3次后，10 000 r/min离心5 min收集菌体，去除上清后加入45 ml生理盐水重悬菌体待用。
取750 g粉碎的玉米，225 g切碎的红辣椒（保留其汁液和水分），3.15 g粉碎的花椒、胡椒，45 ml待用菌液（对照组加入等量的生理盐水）。混合均匀，装入坛中，用水封口后30 °c培养箱中发酵20 d。鲊广椒发酵完成后，取300g样品装入样品瓶中，－20 °c保存备用。
（4）基于电子鼻技术恩施鲊广椒风味品质的评价
取10 g鲊广椒置于电子鼻样品瓶中，室温下平衡30 min，采用电子鼻技术对挥发性物质进行检测。设置参数：进样吸气流量200 ml/min，传感器清洁时间90 s，调零时间5 s，测定时间60 s，每隔1 s测量1个响应值。电子鼻有10个金属氧化传感器，每个传感器与其对应的敏感物质如表2-11所示[11]。
表2-11 金属传感器及其对应的性能描述
续表
（5）统计学分析
通过dnaman对测序结果进行统计处理，利用mega5软件的邻接法（neighbor-joining，jn）构建系统发育树，利用the sas v8和origin 2017进行电子鼻统计分析。使用聚类分析（cluster analysis，ca）和主成分分析（principal component analysis，pca），对加入不同乳酸菌的鲊广椒的风味进行差异性分析。