2.2.2 结果与讨论-凯发娱乐
1.细菌miseq高通量测序分析
使用miseq高通量测序技术对3个样本进行测序，共获得152 488条高质量序列，平均每个样品测得的序列数为50 829条。采用两步uclust进行序列归并，在100%相似度下共捕获67 316条代表性序列，在97%相似度下共划分得到4 561个otu，根据各otu中挑选的代表性序列与数据库比对情况，统计微生物各分类水平数量并进行α多样性分析，结果如表2-5所示。
表2-5 各分类水平鉴定结果及α多样性分析
注：样品的测序量为48 010条序列时，计算得到每个样品的超1指数和香浓指数。
由表2-5可知，lbs03中检测出4个门、13个纲、19个目、23个科以及33个属，其细菌微生物在各分类水平的数量均较lbs01和lbs02的多，α多样性分析结果亦显示lbs03的香农指数最大，这说明lbs03样品的细菌多样性最高。由表3-5亦可知，lbs02超1指数大于lbs01和lbs03，这说明lbs02样品的细菌丰度最大。根据比对结果，本研究对各细菌门在各样品中的相对含量进行了分析，结果如图2-6所示。
图2-6 细菌门相对含量的比较分析
由图2-6可知，恩施酸萝卜中细菌主要隶属于firmicutes、proteobacteria、bacteroidetes（拟杆菌门）和actinobacteria（放线菌门），其平均相对含量分别为98.09%、1.59%、0.18%和0.01%。由图2-6亦可知，firmicutes在各样品中的相对含量均在95%以上，而平均相对含量仅次于firmicutes的proteobacteria在lbs03中的含量要明显高于lbs01和lbs02。值得一提的是，在lbs02中未检测出actinobacteria，说明各样品中细菌的种类存在差异。曹佳珞等采用单分子实时测序技术（single molecule real-time sequencing technology，smrt）对四川传统泡菜盐水中细菌多样性进行研究，发现其优势菌门为firmicutes和proteobacteria[21]，这与本研究结果有相似之处。
采用miseq高通量测序技术从3个样本中共检测出70个细菌属，仅有7.69%的序列不能鉴定到属水平。本研究将平均相对含量大于0.1%的细菌属定义为优势属，其种类及相对含量如图2-7所示。
图2-7 优势细菌属相对含量的比较分析
由图2-7可知，恩施酸萝卜中的优势细菌属及其平均相对含量分别为lactobacillus（乳酸杆菌属，55.76%）、pediococcus（小球菌属，34.50%）、acetobacter（醋酸杆菌属，0.83%）和pseudomonas（假单胞菌属，0.19%）。其中lactobacillus在lbs03中的相对含量高达93.79%，远高于lbs01（28.46%）和lbs02（45.02%），而pediococcus在各样品中的相对含量却呈相反的趋势。此外，acetobacter在lbs03中的相对含量为2.50%，而在样品lbs01和lbs02中均未检出。
本研究进一步在otu水平上对3个酸萝卜中细菌多样性进行了解析，在lbs01、lbs02和lbs03中共发现1 665个、1 843个和2 169个otu，其中有320个otu存在于所有样品中，其累计平均相对含量为29.67%。由此可见，酸萝卜中含有较多核心细菌菌群。本研究将在所有样品中均存在的otu定义为核心otu，同时对平均相对含量大于0.1%的核心otu进行了分析，结果如图2-8所示。
由图2-8可知，平均相对含量大于0.1%的核心otu有34个，其中有26个隶属于lactobacillus，2个隶属于pediococcus，另有5个otu不能鉴定到属水平。平均相对含量排名前3的otu分别为otu799（隶属于pediococcus）、otu3411（隶属于lactobacillus）和otu1018（lactobacillus），其在lbs01、lbs02和lbs03中的相对含量分别为17.78%、13.95%和0.21%，0.19%、4.93%和4.34%，0.45%、2.45%和4.33%。由此可见，虽然酸萝卜发酵液中含有较多核心细菌菌群，但各样品间细菌类群的含量存在较大差异。
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图2-8 核心优势otu相对含量热图
注：图左侧为根据各otu序列构建的进化树。
2.细菌及乳酸菌dgge指纹图谱分析
根据双链dna分子的解链温度及对变性剂的敏感性不同，dgge可将碱基对组成存在差异的双链dna分子区分开，然后通过变性凝胶中条带数目和亮度直观表现样本中微生物的多样性和相对含量[22]。本研究使用dgge对样本中细菌多样性以及高通量测序检测出的相对含量最高的乳酸杆菌属的多样性进行解析，结果如图2-9和表2-6所示。
图2-9 乳酸菌dgge指纹图谱
由图2-9可知，乳酸菌dgge图谱中共挑选出6个优势条带，其中条带3和条带5为样品共有条带。采用同样的模板量、扩增条件以及上样量，但各条带在各泳道中的亮度却不同，说明即使样本中都含有同一种菌，但其在各样本中的含量存在一定差异，这与高通量测序分析结果一致。将回收的条带扩增测序后在genbank上比对，比对结果如表2-6所示。
表2-6 dgge指纹图谱优势条带序列分析
由表2-6可知，条带l1、l3、l4、l5和l6分别被鉴定为l.sakei subsp.sakei、l.senmaizukei、l.insicii、l.acetotolerans和l.kefiri，而条带l2无法鉴定到具体的种属。
3.乳酸菌分离纯化及鉴定
采用传统微生物学手段从3个酸萝卜样品中共分离出17株疑似乳酸菌，其中3株革兰氏染色阴性或过氧化氢酶试验结果为阳性，故只保留了14株。将这14株乳酸菌序列与数据库里的标准菌株进行比对，相似度均为99%。对各分离菌株间亲缘关系进行分析，结果如图2-10所示。
图2-10 乳酸菌与模式株系统发育树
由图2-10可知，从lbs01、lbs02和lbs03中分离出的乳酸菌菌株数量分别为6株、4株和4株，这些菌株主要隶属于lactobacillus和enterococcus。其中lbs01-6、lbs01-8、lbs02-1、lbs01-4和lbs03-1为l.plantarum subsp.plantarum（植物乳杆菌植物亚种），lbs01-5和lbs02-2为e.faecium，lbs03-5为l.brevis（短乳杆菌），lbs03-2和lbs03-3为l.paracasei subsp.paracasei（副干酪乳杆菌副干酪亚种），lbs01-1和lbs01-3为l.fermentum（发酵乳杆菌），lbs02-3和lbs02-4为l.alimentarius（食品乳杆菌）。